Автореферат диссертации по медицине на тему Перекисное окисление липидов при эпилепсии. Антиоксиданты в противосудорожной терапии
АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ И ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИОЛОГИИ
НИКУШКИН ЕВГЕНИЙ ВАСИЛЬЕВИЧ
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ПРИ ЭПИЛЕПСИИ. АНТИОКСИДАНТЫ В ПРОТИВОСУДОРОЖНОЙ ТЕРАПИИ.
14.00.16 - патологическая физиология 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
На правах рукописи
УДК 616.853 [616.831+615.7861-008.939.15
Москва - 1991
габота выполнена в лаборатории общей патологии нервной системы Научно-исследовательского института общей патологии и патологической физиологии АМН СССР.
Научный консультант-
доктор медицинских наук, профессор, академик АМН СССР Г. Е Крыжановский
Официальные оппоненты-до1«'ор биологических наук, профессор, член-корреспондент Российской академии , технологических наук К Б. Спиричев доктор медицинских наук, профессор, " член-корреспондент 'АМН СССР 51 Б. Ганнушкина доктор медицинских наук, профессор Ф. 3.' Меерсон
Ведущее, учрежден к е-
Есесоюзный научный центр психического здоровья
АМН СССР.
Защита диссертации состоится _199>'-г.
в часов на заседании Специализированного совета
Д 001.03.01 при Научно-исследовательском институте общей патологии и патологической физиологии АМН СССР (125315, Москва, ул. Балтийская, 8)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.
Автореферат оагрслан & 1991 г.
Ученый секретарь Специалигированного совета кандидат медицинских наук
Л. Н. Скуратовская
i "л- i а. лмм'.з Отдел
^ССОрТАЦИЙ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. По оценкам ВОЗ, эпилепсией в мире страдает более 30 - 40 миллионов человек. Частота заболеваемости эпилепсией варьирует в широких пределах в зависимости от уровня экономического развития страны и рассматриваемого возрастного диапазона. Так в США она составляет в среднем 48 человек на 100000 населения, с максимумом в возрасте до 5 лет - 152/100000 и снижением до 40/100000 в возрасте 20-70 лет (А.V.Delgado-Escueta et al.,1986). В странах Восточной Европы этот показатель в среднем составляет 117-220 на ЮОООО населения, а в развивающихся странах он нередко превышает 10-20 человек на 1000 населения (В. Г. Ротштейн и др.,1987). В среднем частые и выраженные судорог» встречаются у 3 человек на 1000 населения, нередко вызывая полную утрату трудоспособности и обусловливая высокую смертность.
В связи с этим в различных лабораториях и клиниках мира было направлено много усилий на синтез новых эффективных проти-восудорожных препаратов, на разработку новых методов лечения эпилепсии. Однако, несмотря на то, что арсенал современных про-тивосудорожных средств насчитывает несколько десятков соединений, существующие методы лечения эпилепсии оказываются малоэффективными по крайней мере у 1/4 больных этим заболеванием (А.V.Delgado-Escueta et al.,1986). В значительной степени это обусловлено недостаточно полным пониманием патогенеза эпилепсии и в особенности на клеточно-мембрано-молекулярном уровнях.
В связи с вышесказанным открытие новых звеньев в патогенетических цепях эпилепсии и выяснение их роли, а также поиск на основании этих данных новых противосудорожных средств и разработка эффективных методов терапии эпилепсии являются одной из актуальных задач мировой медицины, решение которой имеет также важное социально-экономическое значение.
Сокращения: АО - антиоксидант!ы), A0A - АО-активность, АОС - АО-система, ГП - глутатионпероксидаза, ГПУВ - генератор патологически усиленного возбуждения, ГР - глутатионредуктаза, ЖК - жир-ная(ы) кислота(ы), ПИК - полиненасыщенные ЖК, СЖК - свободные ЖК, ИИР - интериктальный разряд, ИР - иктальный разряд, 3-ОП -2-этил-6-метил-3-оксипиридин, ПОЛ -перекисное окисление липидов, АЗПОЛ - аскорбат-зависимое ПОЛ, ФП0Л - ферментативное ПОЛ, СМЖ -спинномозговая жидкость, СОД - супероксиддисмугаза, ТБКП - продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой, ТФ - а-токофе-рол, ФГл - фосфолипазный гидролиз липидов, ФСМ - фракция синап-тических мембран, ЦНС - центральная нервная система, ЭКоГ -электрокортикограмиа, ЭпА - эпилептическая активность.
Современные взгляды на патофизиологию эпилепсии базируютс5 на представлении о том, что в основе эпилептических припадко! лежит гиперактивность группы нейронов, обладающих особыми морфологическими, физиологическими, биохимическими и др. свойствами, которые составляют . эпилептический очаг (В.А.Карлов,1390; Г. Н.Крыжановский,1980-1991(.Последний представляет собой частны! случай генератора патологически усиленного возбуждения (ГПУВ) -агрегата синхронно работающих в самоподдерживающем режиме гиперактивных нейронов (Г.Н.Крыжановский, 1980-1991). Поскольку, согласно теории генераторных механизмов (Г.Н.Крыжановский,1980-1991) возникновение и функционирование ГПУВ лежит в основе патогенеза многих невропатологических синдромов (болевых, двигательных, эмоционально-поведенческих, психозоподобных и др.), то изучение механизмов возникновения, развития и подавления эпилептических очагов представляет собой собственную актуальную задачу, выходящую за рамки аналогичных задач в проблеме эпилепсии.
Исходя из представлений, сформированных к концу 70-х годо1 в цитологии и мембранологии, можно прийти к выводу о том, чт< механизм повреждения клеток разных тканей,в том числе и,нервной, включает в себя два типа стадий или этапов: 1) специфические, определяемые видом повреждающего агента или фактора, а также структурно-функциональными особенностями пораженного отдела ил! органа и 2) неспецифические, универсальные, присутствующие независимо от вида повреждающего начала н свойств пораженной мишени, Нарушения регуляции в клетке процесса свободнорадикального пере-кисного окисления липидов (ПОЛ) наблюдаются, как правило, н; второй этапе повреждения клетки, хотя в ряде случаев процес< повреждения может с них начинаться. Вместе с тем они универсальны, поскольку встречаются при самых разнообразных заболеваниях 1 патологиях. Важными особенностями реакций ПОЛ является их цепно! характер, что обусловливает способность реакций к самоускоретн и их тесная взаимосвязь с множеством других клеточных процессов Благодаря этому вклад нарушений регуляции процесса ПОЛ, их последствий в суммарное повреждение клетки (ткани) может превышав вклад специфических стадий и определять вероятность переход; обратимых изменений клеточного метаболизма и структуры в необратимые.
В экспериментально-клинических исследованиях последней
десятилетия нарушения регуляции процесса ПОЛ были обнаружены при ишемии (М.В.Биленко,1989; Ф.З.Меерсон и др.,1983) и травме (М.Ш.Промыслов и др.,1991) головного мозга, при шизофрении (Л.Л.Прилипко, Р.Р.Лидеман,1982; А.М.Michelson, 1982), рассеянном склерозе (Н. И. Роговина,А.П.Хохлов,1980; G.2. Mazzella et al.. ,1983), болезнях Паркинсона (J. Clausen, 1984; S.J.Klsh et al., 1985),Альцгеймера и Боттена-Шгейнерта-Куршмана (J.Clausen,1984), а также при стрессе (Ф.З.Меерсон,1979-1991), центральных параличах (M.Kibata et а1.,1977).инфекциях (И.Т.Ильчук,1983), отравлениях тяжелыми металлами tJ,Donaldson et al.,1982) и других поражениях центральной нервной системы (ЦНС). Несомненная важность нарушений в системе регуляции процесса ПОЛ для патогенеза заболеваний ЦНС доказывается тем обстоятельством, что факторы (соединения) предотвращающие или устраняющие дисбаланс, возникающий в системе регуляции ПОЛ, в частности антиокснданты, замедляли развитие патологического процесса и ослабляли его интенсивность вплоть до полного подавления!М.В. Биленко,1989; Г.Н.Крыжановский и др., 1984; Ф.З.Меерсон и др.,1983,1986,1988; С.Л.Няньковский, М.Ф.Тимочко,1386; А.Р. Рахимджанов и др.,1989; С.С.Рыбалова,1981;J.Suzukli et al.,1385; J.Z.Cadet et al.,1989).
Вместе с тем исследований, посвященных изучению состояния ПОЛ в очагах гиперактивности и у больных, эпилепсией, а также выяснению роли возможных нарушений регуляции этого процесса при эпилептогенезе практически не проводилось. Это послужило основанием для выполнения работы, результаты которой изложены в данной диссертации.
Исследования проводились в рамках научно-технической программы ГКНТ СССР 0.69.04 "Разработка и внедрение методов и средств профилактики, лечения и реабилитации больных психическими заболеваниями" и Общесоюзной отраслевой научно-технической программы в области медицины С.01 "Изучение общих закономерностей патологических процессов и разработка принципов и методов их коррекции".
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель настоящей работы заключалась в изучении состояния процесса ПОЛ при эпилепсии, выяснении патогенетической значимости и механизма нарушений регуляции данного процесса, а также в разработке методов их профилактики и коррекции.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить вид и выраженность нарушений протекания процессг ПОЛ в областях гиперактивности головного мозга лабораторных животных (крыс) при моделировании у них очаговой и первично-генерализованной эпилепсии.
2. Выяснить патогенетическое значение и механизм нарушена регуляции процесса ПОЛ при экспериментальном -эпилептогенезе.
3. Определить возможности профилактики и коррекции нарушений регуляции ПОЛ при эпилептогенезе; разработать методику использования антиоксидантов в экспериментальной противосудорожно{ терапии.
4. Исследовать состояние процесса ПОЛ у взрослых больных с разными формами эпилепсии и у детей с судорожным синдромом.
5. Выявить факторы и клинические признаки эпилепсии,наличие и выраженность которых связана с уровнем продуктов ПОЛ в кровр больных этим заболеванием.
6. Изучить возможность и целесообразность использованш антиоксидантов в комплексной противосудорожной терапии.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В работе впервые проведено комплексное экспериментально-клиническое исследование состояния процесса ПОЛ у лабораторных животных (крыс) с моделями разных фор» эпилепсии, а также у взрослых больных эпилепсией и детей ( судорожным синдромом.
Установлено, что развитие у крыс, очаговой и первично-генерализованной эпилептической активности (ЭпА) сопровождаете: нарушениями регуляции в . области гиперактивности процесса ПОЛ, приводящими к его некомпенсированной активации. При этом наблюдается значительное повышение уровня продуктов ПОЛ в .спинномозговой жидкости в периферической-крови.
Впервые доказано, что нарушения регуляции ПОЛ являютс: важным звеном в патогенезе ЭпА. Установлено, что антиоксиданты а-токоферол (ТФ), ионол, 2-этил-6-метил-3-оксипиридин и эноме-ланин обладают выраженным противосудорожным действием, а препараты, широко используемые в противосудорожной терапии :фенобарбитал, дифенин, вальпроат натрия и феназепам ингибируют ПОЛ i условиях in vitro.
Показано, что нарушения ПОЛ при эпилептогенезе имеют вто ричный характер и что одним из механизмов, приводящих к неком
пенсированной активации ПОЛ при развитии ЭпА, является активация в области гиперактивности эндогенных фосфолипаз типа А. Установлено, что некомпенсированной активации ПОЛ при развитии ЭпА способствует функциональная недостаточность антиоксидантной системы (ДОС). Увеличение мощности ДОС с помощью введения животным антиоксидантов или препарата супероксиддисмутазы (СОД) существенно замедляло индукцию ЭпА и уменьшало ее интенсивность.
У больных с различными формами эпилепсии и детей с судорожным синдромом впервые обнаружены нарушения регуляции процесса ПОЛ,о чем свидетельствует резкое увеличение содержания продуктов ПОЛ в крови больных. Кроме того в- крови больных эпилепсией, длительное время страдающих заболеванием с высокой частотой припадков, снижена активность антиохсидантных ферментов.
Впервые показано, что назначение больным эпилепсией с значительными нарушениями регуляции процесса ПОЛ дополнительно к традиционной п'ротивосудорожной терапии антиоксиданта - а-токо-ферола нормализует биохимические показатели и дает положительный терапевтический эффект.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ. ЗНАЧИМОСТЬ. Полученные результаты позволили обнаружить в цепях эпилептогенеза новое звено - нарушения регуляции в области гиперактивности процесса ПОЛ. Установлено, что эти нарушения являются одним из вторичных звеньев. Нарушения регуляции ПОЛ приводят к некомпенсированной активации данного процесса, одной из причин чего является активация эндогенных фосфолипаз типа А. Реализации этой и других причин активации ПОЛ способствует функциональная недостаточность ферментов АОС.
Учитывая то обстоятельство, что очаг ЭпА представляет собой частный случай ГПУВ, можно полагать, что нарушения регуляции ПОЛ являются существенным звеном в патогенезе других нейропатологи-ческих синдромов,' в основе возникновения которых лежит образование в ЦНС ГПУВ.
Обнаружение новых свойств у использованных-антиоксидантов -противосудорожных и новых свойств у примененных противосудорож-ных препаратов - антиоксидантных подтверждает патогенетическую значимость нарушений регуляции ПОЛ для эпилептогенеза и углубляет существующие представления о молекуляркых механизмах действия апробированных соединений.
В результате проведенных исследований сформулировано новое
научное направление, имеющее существенное значение для развития теоретической и практической медицины: изучение роли нарушений регуляции процесса перекисного окисления липидов ЦНС в патогенезе эпилепсии.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработан в эксперименте и успешно апробирован в клинике метод лечения эпилепсии с помощью включения антиоксиданта - а -токоферола в комплексную противосудо-рожную терапию (Автор, свид. N 1152591 от 3 января 1985 г.).
Результаты исследований по изучению противосудорожного действия антиоксиданта - 2-этил-6-метил-3-оксипиридина вошли в основные материалы по препарату оксипин, представленные в Фармакологический комитет МЗ СССР. Решением Фармакологического комитета МЗ СССР (протокол N 21 от 13 декабря 1985 г. ) оксипин разрешен для изучения в психиатрических клиниках, в том числе и при лечении эпилепсии.
Обнаружение противосудорожных свойств у антиоксидантов: ио-нола, эномеланина, никотинамида позволяет рекомендовать их для дальнейших испытаний с целью получения новых лекарственных препаратов.
Наличие противосудорожного действия у антиоксидантов, относящихся к разным классам химических соединений следует использовать при направленном поиске новых антиэпилептических средств.
Разработанные в диссертации теоретические подходы и методические приемы используются во Всесоюзном научном центре психического здоровья АМН СССР, Институте фармакологии АМН СССР, Институте геронтологии АМН СССР, Одесском медицинском институте им. Н. И.Пирогова, Ростовском ордена Дружбы народов медицинском институте.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. При эпилепсии наблюдаются нарушения регуляции процесса ПОЛ, проявляющиеся его некомпенсированной активацией и являющиеся существенным звеном патогенеза данного заболевания.
2. Актиоксиданты: а-токоферол, ионол, 2-этил-6-метил-3-оксипиридин и эномеланин обладают выраженным противосудорожным действием.
3. Нарушения регуляции ПОЛ при эпилептогенезе имеют вторичный характер.
4. В механизмах нарушения регуляции процесса ПОЛ при эпи-
лептогенезе существенную роль играет активация в области гипер-активностн эндогенных фосфолипаз типа А и функциональная недостаточность АОС.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзном симпозиуме "Структура,биосинтез и превращение липидов в организме человека и животных" (Ленинград, 1978), VIII, IX и X Всесоюзных конференциях по биохимии нервной системы (Минск,1980; Ереван, 1983; Горький, 1987), V Всесоюзном семинаре "Развитие общей теории функциональных систем" (Москва, 1979),II Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Ташкент, 1980), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Международном симпозиуме'"Нейрофизиологические механизмы эпилепсии" (Тбилиси, 1982), I, II и III Всесоюзных конференциях "Биоантиоксидант" (Москва, 1983; 198S; 1989), V Всероссийской конференции детских невропатологов и психиатров (Уфа, 1983), IV Всесоюзной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР Х.Ч.Коштоянца (Москва, 1985), V Всесоюзной конференции по медицинской энзимологии (Махачкала, 1988), I Болгаро-советском симпозиуме "Свободные радикалы и биостабилизаторы (Sofia, Bulgaria,. 1987), Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Минск, 1988), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. .Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы с изложением материалов и методов исследования и 5 глав, посвященных изложению результатов собственных исследований и'их обсуждению), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит 43 рисунка и 21 таблицу. Список литературы включает 350 источников, из которых 136 опубликовано в отечественных и 214 в зарубежных изданиях.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Экспериментальная часть работы состоит из двух разделов. В 1-ом разделе приводятся данные, полученные в лабораторных условиях в экспериментах на животных (гл.IV-VI): на белых беспородных крысах - самцах (2Q0 животных) и белых крысах - самцах линии Вистар (1200 животных). Беспородных животных использовали для приготовления гомогенатов головного мозга и выделения из них
субклеточных фракций, которые в дальнейшем'применяли для биохимических исследований в опытах in vitro. Во всех остальных случаях использовали крыс линии Вистар. Животные имели массу тела 160-250 г, их содержали в условиях вивария на стандартном рационе без ограничений в воде и пище с естественной сменой освещенности.
Данные, изложенные во 2-ом разделе, представляют собой результат обследования 140 человек. 70 из них это мужчины в возрасте 23-39 лет, больные различными формами эпилепсии. Их обследование проводилось на' базе Тверской областной психиатрической больницы им. докт. Д.Литвинова (44 больных), кафедры нервных болезней Московского медицинского стоматологического института им. Н.А.Семашко (13 больных) и психоневрологического диспансера N 12 г.Москвы (13 больных). 45 человек из общего числа обследованных - дети с судорожным синдромом в возрасте от нескольких месяцев до 1.5 лет, находившиеся на излечении в отделении патологии нервной системы новорожденных клинической больницы N 1 г.Москвы. 25 обследованных - мужчины в возрасте 20-38 лет, не страдающие ни психическими, ни хроническими соматическими заболеваниями (контроль).
Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для исследования у крыс ЭпА использовали модель очаговой пенициллин-идуцированной ЭпА и модель первично-генерализованной бемегрид-индуцированной ЭпА (D.Purpura et al.,1972; R.Fisher, 1989). Изучение постепенного возрастания чувствительности крыс к действию эпилептогена проводили с помощью коразол-индуцированно-го феномена "раскачки" (коразоловый "киндлинг") (J.Wada,1986; Г.Н.Крыжановский и др.,1988).
Интенсивность очаговой и первично-генерализованной ЭпА оценивали по ЭКоГ. В случае очаговой ЭпА определяли длительность латентных периодов появления 1-ого интериктального разряда (ИИР) и 1-ого иктального разряда (ИР),а также длительность и число ИР, наблвдаемых за время функционирования очага ЭпА. В случае первично-генерализованной ЭпА определяли длительность латентных периодов появления судорожных вздрагиваний и начала клонико-тони-ческих судорог, а также интенсивность судорог и число животных, выживших после введения летальных доз бемегрида. Интенсивность судорог выражали в баллах.
В экспериментах на очаговой модели ЭпА отбирали ткань коры головного мозга из области очага ЭпА и кровь из бифуркации нижней полой вены.Ткань мозга (2-3 мг) отбирали через через 15-30 мин после аппликации пенициллина, то есть на стадии выраженной ЭпА. Кровь отбирали у животного находившегося под легким хлороформным наркозом, через 10-20 мин после окончания функционирования очага ЭпА.
В опытах на модели первично-генерализованной ЭпА исследовали целый головной мозг (без мозжечка), суммарную кору больших полушарии, кровь из сосудов головы и шеи,а также кровь из нижней полой вены. Крыс декапитировали через 2-4 (период начальных судорожных проявлений), 4-6 (на высоте судорожного приступа), 6-8 (сразу же после приступа генерализованных судорог) и через 20 мин после инъекции бемегрида (т.е. через 10-15 мин после генерализованного приступа).
СМЖ (20-40 мкл) отбирали через 20 мни после инъекции бемегрида с помощью цистернальной пункции.
При феномене "раскачки" исследовали целый мозг (без мозжечка) и кровь из сосудов головы и шеи. Крыс декапитировали- на 5,17 и 32-е сутки после первого введения коразола. В день забоя кора-зол животным не вводили.
Целый головной .мозг крысы (без мозжечка), участки его сен-сомоторной коры из области очага ЭпА и суммарную кору больших полушарий гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефло-новым пестиком. Полученные гомогенаты либо непосредственно использовали для биохимического анализа, либо предварительно выделяли из них цитозольную фракцию (И. Р. Тупеев и др. ,1985), фракцию синаптосом (F.Hajos,1975)) и фракцию синаптических мембран (ФСМ) (М.М.Бордюков и др.,1985). Кровь центрифугировали в течение 1620 мин при 3000 об/мин и температуре 0-4°С. Отбирали плазму, добавляли в нее ЭДТА до конечной концентрации - 3-5 мМ и хранили при -20° С до 7 сут. Для получения лизата эритроцитов к 1 мл эритроцитарной взвеси добавляли 1 мл 0.2% раствора детергента -тритон Х-100, содержавшего 2 мМ ЭДТА. В пробах, используемых для определения активности СОД, осаждали гемоглобин.
-Концентрацию белка в исследуемых образцах определяли по методу (O.Lowry et.al.,1951). Концентрацию гемоглобина в лизате эритроцитов определяли по (И.Тодоров,1968).
Кровь у больных эпилепсией, здоровых 'доноров,а также детей с судорожным синдромом брали из локтевой вены (у детей иногда из височных вен кожи головы) утром натощак. СМЖ получали путем люм-бальной пункции также утром натощак. Полученные образцы хранили при -20°С не более 2-7 сут.
Наличие и•величину трансмембранного потенциала синаптосом (ТМПС) определяли с помощью метода флуоресцентных потенциал-чувствительных зондов используя - 3.3-дипропилтиодикарбоцианин - diS-C3-(5) (М.Blaustein,J.Goldring,1975).
Микровязкость липидного бислоя синаптических мембран измеряли по поступательной диффузии флуоресцентного зонда пирена (Ю.А.Владимиров,Г.Е.Добрецов,1980). Аффинность бензодиазепиновых рецепторов определяли методом радиолигандного анализа (Л.Л.При-липко и др.,1983), используя метку - 3Н-И-метил-диазепам.
Длительную деполяризацию синаптосом вызывали тремя способами: 1) электростимуляцией суспензии синаптосом по (H.Bradford, 1970), 2) увеличением концентрации в среде инкубации ионов К+ до 33 мМ, 3) ингибированием Na.K-АТФ-азы синаптических мембран уа-баином.
В гомогенатах, суспензиях синаптосом, ФСМ и липосом индуцировали аскорбат-зависимое ПОЛ (АЗПОЛ) с помощью смеси FeCl ^аскорбиновая кислота (10"5и г'Ю'^М соответственно). В гомогенатах и суспензиях синаптосом индуцировали также ферментативное ПОЛ (ФПОЛ) путем введения в среду инкубации смеси ЕеС1г+НАДФ'Н (Ю-5 и 2'10"4М соответственно).В суспенизиях синаптосом ПОЛ индуцировали также, облучая суспензию УФ-светом.
Липиды экстрагировали с помощью модификации метода (Е.Bligh.W.Dyer,1959).В экстрактах определяли содержание диеновых коньвгагов (J.Bol land,Н. Koch, 1945) и оснований Шиффа (W.Bidlack,^.Tappel,1973).Концентрацию ТБКП измеряли как описано в работе (Е.В.Никушкин и др.,1989).
Состояние АОС (оценивали по активности в тканях супероксид-дисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и глутатионредуктазы (ГР) и по содержанию ТФ. Активность СОД, ГП и ГР определяли в цитозольных фракциях клеток коры головного мозга и целого мозга (без мозжечка) крыс, а также в эритроцитах крыс и человека (С.Beanchamp,I.Fridovich,1971; В.З.Ланкин, С.М.Гуревич, 1976; Y. Yawata, К. Tanaka,1974). Содержание ТФ измеряли в гомогенатах
коры головного мозга крыс и в плазме крови крыс и человека (D.Taylor,1956). Кроме того, у крыс исследовали перекисную резистентность эритроцитов!М.Clemens,Н.Remmer,1982).
Содержание СЖК в гомогенатах ткани мозга, суспензиях субклеточных -фракций и в плазме крови определяли по модифицированной методике (В. А. Шатерников, А. А. Савчук,1964). Состав CJKK анализировали методом газо-жидкостной хроматографии.
а-токофероя ацетата вводили крысам внутрибрюшинно в дозах 0.1-100 мг/кг массы за 1 сут до индукции ЭпА. Больным эпилепсией АО назначали в виде масляного раствора а-токоферол ацетата в капсулах (50 '/. раствор). Препарат давали внутрь по 600 мг ,1 раз в сутки после еды. Продолжительность курса была 1 мес.
Ионол вводили крысам внутрибрюшинно в дозах 0.1-100 мг/кг массы за 1 сут до индукции ЭпА. Хлорид' 2-этил-6-метил-3-окси-пиридина (3-ОП) вводили крысам внутрибрюшинно в дозах 25-150 мг/кг массы либо за 45 мин до индукции ЭпА, либо через 15-25 мин после аппликации пенициллина. Эномеланин вводили животным внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг массы через 15-25 мин после индукции ЭпА. СОД вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг массы за 30 мин до индукции ЭпА.
ЭКоГ крыс регистрировали в помощью полиграфа RM 86 фирмы "Nihon Kohden" (Япония). Спектры оптической плотности растворов регистрировали на спектрофотометре "Hitachi 320" (Япония), а спектры флуоресценции на спектрофлуориметре MPF-4 фирмы "Hitachi". Радиоактивность препаратов измеряли на счетчике фирмы "Beckman" (США). Состав СЖК определяли на хроматографе CHR0M-4 (ЧССР).
В работе были использованы реактивы в основном фирм "Serva" (ФРГ),"Sigma" (США) и "Merck" (Австрия).
Глава IV. ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРОЦЕССА ПЕРЕКИСН0Г0 ОКИСЛЕНИЯ.
ЛИПИД0В В ЦНС КРЫС ПРИ РАЗВИТИИ ЭПИЛЕПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.
Аппликация - пенициллина, на симметричные участки сенсомо-торной коры головного мозга-крыс приводила к появлению на ЭКоГ, характерного паттерна ЭпА.Через 1-3 мин после аппликации на фоне нормальной ЭКоГ появлялись отдельные ИИР с амплитудой порядка 200-400 мкВ. Амплитуда ИИР быстро возрастала, достигая 800-1200 мкВ, и через 4-8 мин на ЭКоГ регистрировался ИР - "залп" высоко-
частотных колебаний с частотой более 3-х разрядов за 1 с и длительностью 20-30 с. После каждого ИР наблюдался период рефрак-терности продолжительностью 0.2-2.0 мин; затем вновь появлялись ИИР,переходящие через 1-2 мин в очередной ИР. Описанные переходы ИИР в ИР наблюдались в течение 1.5-2.5 ч, после чего ИР прекращались,' а ИИР начинали постепенно "угасать", уменьшаясь по амплитуде и частоте, и через 2.5-3.0 ч исчезали полностью. Это время считали временем жизни очага ЭпА;всего за него регистрировали от 30 до 70 ИР. Электрическая активность была синхронизирована в правом и левом полушариях головного мозга. . 5
Содержание ТБКП в коре головного мозга контрольных крыс, составляло около 0.5 нмоль/мг белка. Уровень ТБКП был одинаков в левом и правой полушариях головного мозга. Развитие в коре головного мозга крыс фокальной ЭпА сопровождалось резким увеличением содержания продуктов ПОЛ в коре области,гиперактивности. Отмечалось возрастание уровня разных типов продуктов ПОЛ: диеновых конъюгатов, ТБКП и оснований Шиффа. Степень прироста не зависела от тестируемого полушария и варьировала в зависимости от типа продуктов с 20 до 150 У. от контроля. Параллельно с накоплением продуктов ПОЛ в коре головного мозга крыс отмечалось примерно такое же возрастание их уровня в плазме периферической крови.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что индукция пенициллином очага ЭпА в кчре головного мозга крыс сопровождается активацией в области гнперактивности процесса ПОЛ. Поскольку обнаруженное усиление ПОЛ могло быть связано с прямым проокси-дантным действием пенициллина, то в условиях in vitro было изучено влияние данного конвульсанта на активность ПОЛ в синаптосо-мах, выделенных из коры головного мозга интактных животных. Установлено, что инкубация синаптосом с пенициллином (от 10"6до 10~3 М> не влияет на содержание в суспензии ТБКП. Следовательно, пенициллин прооксидантного действия не оказывал. Исходя из этого, можно полагать, что зарегистрированная активация ПОЛ была связана непосредственно с развитием у крыс ЭпА. Правильность этого вывода подтверждается результатами двух других серий экспериментов. Из них 1-я серия опытов отличалась от вышеописанной тем, что пенициллин апплицировали на сенсомоторнуи кору только одного полушария головного мозга крысы, а во 2-ой серии
опытов интенсивность процесса ПОЛ определяли в тех областях коры головного мозга крыс, в которых нормальная ЭКоГ регистрировалась и после возникновения очага ЭпА в сенсомоторной коре. В частности нормальная ЗКоГ наблюдалась в зрительной коре.
При аппликации пенициллина на сенсомоторную кору только одного полушария (левого) головного мозга крыс в области воздействия конвульсанта возникал первичный очаг ЭпА, а в симметричном, гомотопическом участке другого полушария возникал вторичный -"зеркальный" очаг ЭпА. Электрическая активность в первичном -детерминантном и в "зеркальном" очагах была полностью синхронизирована. Установлено, что при аппликации конвульсанта только на одно полушарие увеличение уровня продуктов ПОЛ наблюдается в равной степени как в коре области детерминантного, так и в коре области "зеркального" очагов ЭпА. Напротив, содержание продуктов ПОЛ не отличалось от контрольного в области зрительной коры. Итак, развитие в коре головного мозга крыс очаговой ЭпА сопровождалось активацией в области гиперактивности процесса ПОЛ-.
Развитие в коре головного мозга крыс первично-генерализованной ЭпА,вызванной внутримышечным введением животным бемегрида в дозе 17 мг/кг, также сопровождалось резким увеличением содержания продуктов ПОЛ в коре головного мозга. Как и при очаговой ЭпА, увеличивалось содержание разных типов продуктов ПОЛ: диеновых конъюгатов,ТБКП и оснований Шиффа. При этом степень прироста уровня продуктов ПОЛ колебалась в зависимости от их типа в пределах 150-300 '/., от контроля. Параллельно отмечалось 2-х кратное увеличение содержания оснований Шиффа в СМЖ и 3-х кратное возрастание уровня диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в плазме периферической крови.
Ежедневное введение крысам коразола в подпороговых дозах (30 мг/кг внутримышечно) вызывало постепенное нарастание у них судорожной готовности. .Первые судорожные проявления развивались у животных после 7-й инъекции конвульсанта - сначала менее, чем у 10 V. крыс, а через 2 нед - у 80 'А. Интенсивность судорог к этому сроку достигала 1.5 балла. Затем число животных с судорогами и интенсивность последних сохранялись на практически неизменном уровне до 21-22-х суток, после чего величина обоих показателен резко увеличивалась й к 25-м суткам инъекция коразола вызывала интенсивные (3 балла) судороги у всех крыс. В это время
клонические судороги всего туловища сменялись выраженными клонико-тоническими судорогами, и на 30-е' сутки у половины крыс регистрировались клонико-тонические судороги с падением животного на. бок и четкой фазой тонической экстензии - 4 балла.
Содержание ТБКП определяли в гомогенатах головного мозга у животных, разделенных на 3 группы, которые отличались длительностью введения конвульсанта (5,17 и 32-е сутки) и соответственно степенью судорожной готовности.
Установлено, что содержание ТБКП в головном мозге крыс не изменялось по сравнению с соответствующим контролем ни в одной из обследованных групп. По-видимому, индуцируемая коразолом предрасположенность к ЭпЛ„ нарастающая при хроническом введении конвульсанта, формируется'за счет механизмов, не,связанных со свободнорадикальным ПОЛ в нервной системе. Это позволяет думать о том, что активация ПОЛ при развитии ЭпА имеет вторичный характер.
До проведения настоящих исследований активацию процесса ПОЛ в ЦНС животных (крыс) наблюдали при 3-х способах индукции генерализованных судорог, а именно: 1) судорогах, вызванных гипербарической оксигенацией (Р.Лоаппу е1 а1.,1970; А.И.Лукаш и др., 1977), 2) судорогах, индуцированных подкожным введением камфоры (Ю.Е.Вагин и др.,1975), н 3) аудпогенных миоклонических судорогах, возникающих у крыс с генетической к ним предрасположенностью ( линия Крушинского - Молодкиноп ) ( Р.Н.Копаладзе и др.,1976 ). Результаты, описанные в разделах 1-3 настоящей главы, отличаются от ранее полученных данных рядом преимуществ, к которым относится следующее. 1. Исследования активности процессов ПОЛ проводились с обязательным электрофизиологическим контролем. 2. Установлено, что ПОЛ активируется в области ЦНС, где развивается ЭпА и сохраняется на прежнем уровне в области головного мозга, где гиперактивность отсутствует. 3. Показано, что использованные конвульсанты сами, по себе не влияют на- активность ПОЛ в нервной ткани. 4. Активность ПОЛ была обнаружена при очаговой ЭпА, при которой в значительно меньшей степени, чем при генерализованных судорогах,выражены изменения со стороны других систем и органов. 5. В проведенных опытах об активности ПОЛ в нервной ткани судили одновременно по уровню продуктов переокисления трех типов, что практически исключает возможность методических артефактов.
6. Наряду с активацией ПОЛ в коре головного мозга было обнаружено увеличение уровня продуктов ПОЛ в СИ и в периферической крови. 7. Показано, что активация ПОЛ при развитии ЭпА имеет вторичный характер.
В последующем другими авторами были получены новые подтверждения активации процесса ПОЛ в ЦНС при развитии у животных ЭпА.Это прежде всего исследования Willemore и Rubin (1980-1984), продемонстрировавших наличие данного эффекта при очаговой ЭпА, вызванной внутрикорковой инъекцией растворов 2-х и 3-х валентного железа.
Анализируя совокупность полученных данных, можно прийти к трем выводам. 1. Развитие у животных разных форм ЭпА, индуцированных различными конвульсантами, сопровождается некомпенсированным усилием в области гпперактивносги процесса ПОЛ. 2. Активация ПОЛ в ЦНС при развитии ЭпА является вторичной, не связанной с повреждением механизмов нейроналыюй регуляции, предшествующим появлении сиперактивности. 3. Параллельно с активацией ПОЛ в ЦНС при ЭпА наблюдается увеличение уровня, продуктов ПОЛ в крови животных.
Глава V. ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НЕКОМПЕНСИРОВАННОМ АКТИВАЦИИ ПРОЦЕССА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ ПРИ РАЗВИТИИ ЭПИЛЕПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ. ПРОТИ-В0СУД0РОИЮЕ ДЕЙСТВИЕ АНТИОКСИДАНТОВ.
Наиболее адекватным способом выяснения патогенетической роли усиления процесса ПОЛ при возникновении ЭпА является, очевидно, исследование степени и вида зависимости ЭпА от данного эффекта. Прямым способом воздействия на выраженность эффекта активации ПОЛ является введение в организм животного ингибиторов данного процесса - АО. Исходя из этого, было изучено влияние АО на интенсивность ПОЛ в коре головного мозга крыс при ЭпА и интенсивность развивающейся ЭпА. Были применены 4 АО, относящиеся к разным классам химических соединений: жирорастворимые - ТФ и ионол, а также водорастворимые - 3-ОП н эномеланин (смесь полимерных соединений - мёланиновых пигментов).
Предварительное введение крысам ТФ в дозе 100 мг/кг приводило через 1 сут после инъекции к повышению содержания этого АО на 25 "/. в ткани головного мозга и на 50 % в плазме крови. При этом предотвращалась активация ПОЛ в коре головного мозга, наб-
людавшаяся при индукции у животных очаговой и первично-генерализованной ЭпА. Аналогичные результаты получены и при введении ионола в дозе 100 мг/кг до индукции очаговой ЭпА.
Наряду с антмоксидантным действием, предварительное внутри-брюшинное введение ТФ пли ионола оказывало на модели очаговой ЭпА и выраженное противосудорожное действие. В 2.5-3.5 раза увеличивалась длительность латентного периода возникновения первого ИИР; в 3-3.5 раза возрастала длительность латентного периода появления первого ИР и значительно в 5-6 раз уменьшалось число ИР, регистрируемых за время жизни очага ЭпА. Частота ИИР и длительность ИР после введения АО не изменялись. Противосудорожное действие ТФ и ионола зависело от их дозы. Максимальный антиконвульсивный эффект был отмечен при дозе АО - 100 мг/кг.Увеличение дозы АО более 120 мг/кг приводило к снижению их противосудорож-ной активности.
На модели первично-генерализованной ЭпА противосудорожное действие ТФ проявлялось при низких дозах конвульсанта (порядка 10/мг/кг). При дозах бемегрнда 15 мг/кг и более предварительное введение ТФ на клиническую картину судорог практически не влияло. Вместе с тем при судорогах, вызванных такими дозами конвульсанта, ТФ заметно усиливал противосудорожное действие диазепама. При инъекции животным летальных доз конвульсанта АО снижал процент летальных исходов. Так при дозе бемегрида 20 мг/кг предварительное введение ТФ в дозе 100 мг/кг увеличивало выживаемость крыс в 3 раза (Р<0.02).
Водорастворимые соединения, относящиеся к классу 3-оксипи-ридинов, обладают высокой A0A (Т.А.Воронина и др.,1984;1988). Введение крысам 3-0П на фоне уже развившейся очаговой ЭпА вызывало ее ослабление. Противосудорожное действие З-ОП начинало проявляться при дозах АО порядка 50 мг/кг массы и было максимально выражено при введении З-ОП в дозе - 150 мг/кг. Через 1-3 мин после введения З-ОП в этой дозе на стадии выраженной судорожной активности ИР прекращались, а амплитуда и частота ИИР постепенно уменьшались. У 2/3 животных ИР больше не возобновлялись, у остальных крыс они появлялись вновь только через 40-60 мин после инъекции АО.
Предварительное, за 40 мин до аппликации пенициллина, введение З-ОП в дозе 150 мг/кг массы предотвращало появление у
животных ИР. Длительность латентного периода появления первого ИИР увеличивалась при этом с 89 7 с в контроле до 224 + 37 с в группе крыс, которым предварительно был введен 3-0П. Предварительное введение 3-ОП было эффективно и при бемегрид-индуциро-ванной первично-генерализованной ЭпА, в случае использования средних доз конвульсанта!до 20 мг/кг). При инъекции крысам летальных доз бемегрида, 3-ОП существенно увеличивал выживаемость животных.
Введение эномеланина в дозе 100 мг/кг на стадии выраженной очаговой ЭпА аналогично 3-ОП вызывало быстрое угнетение икталь-ной активности. После инъекции АО на ЭКоГ регистрировалось не более 1-2 ИР, а спустя 8-10 мин прекращались и ИИР, после чего ЭКоГ в течение 40-90 мин практически не отличалась от нормальной.
Способность АО - замедлять развитие различных видов ЭпА, а также существенно ослаблять ее интенсивность была подтверждена в работах других авторов. Так Rubin и Willemore (1980; 1981) показали, что введение крысам ТФ в дозе 100 мг/кг массы защищает животного от развития ЭпА, индуцированной внутрикорковой инъекцией растворов железа. Е.Б.Бурлакова и др. (1981) описали противосу-дорожное действие АО из класса 3-окснпиридинов, а Т.В.Архипова и др.(1986) - понола на модели аудпогенных миоклонических судорог. Работы по изучению психотропного действия 3-оксипиридинов, выполненные Т.А.Ворониной, Л. Д. Смирновым и др. (1990), показали, что 3-0П в значительной степени подавляет или предупреждает судороги, вызываемые кобальтом, тносемикарбазидом, коразолом, стрихнином, ареколином и электрическим током.
Эксперименты, проведенные с АО, позволили установить по крайней мере 4 факта, важных для последующих выводов. 1. С помощь» предварительного введения АО можно предотвратить активацию ПОЛ в ЦНС,наблюдавшуюся при развитии различных еидов ЭпА. 2. АО, относящиеся к разным классам химических соединений, обладают-ярко выраженным противосудоромым действием. 3. Несмотря на предотвращение антиоксидантамп активации ПОЛ в ЦНС,воздействие конвульсанта все же вызывает развитие у животных ЭпА, которая впрочем заметно ослаблена и развитие ее существенно отсрочено. 4. Ингибирующее влияние АО на ЭпА в большей степени выражено для иктальной активности, чем для пнтерпктлльнои.
Первые два, из установленных фактов, свидетельствуют о важной роли некомпенсированном активации ПОЛ в генезе ЭпА. 3-й факт подтверждает вывод о вторичности активации ПОЛ при развитии ЭпА. И наконец, на основании 4-го можно говорить о том, что активация ПОЛ, по-видимому, более существенна для генерализации гиперактивности, чем для ее возникновения. Хотя увеличение длительности латентного периода появления на ЭКоГ 1-го ИИР, наблюдаемого после введения крысам жирорастворимых АО, также как и подавление интериктальной активности водорастворимыми АО свидетельствует об участии активированного ПОЛ и в структурно-функциональных перестройках нейрона, приводящих к его гиперактивности.
Следующая серия экспериментов была посвящена изучению влияния противосудорохных препаратов, относящихся к разным классам химических соединении на ПОЛ в модельных биологических системах. Были отобраны 4 соединения, из числа наиболее часто используемых в практике мирового здравоохранения: фенобарбитал, дифенин, фе-назепам и вальпроат натрия. Исследовали их влияние на активность процесса ПОЛ в двух различных по своей метаболической активности системах: 1) лппосомах, сформированных из яичного лецитина, и 2) гомогенатах, приготовленных из ткани головного мозга крыс. В липосомах изучали кинетику накопления ТБКП в ходе АЗПОЛ, в гомогенатах головного мозга - кинетику накопления ТБКП в процессе АЗПОЛ и ФПОЛ.
Установлено,что фенобарбитал в диапазоне концентраций 10~°-10~3М не влияет на АЗПОЛ в липосомах и на ФПОЛ в гомогенате мозга. В то же время в гомогенате мозга фенобарбитал на 20 V. ингибировал АЗПОЛ. Дифенин в концентрациях 10~6- 10~4 М не влиял на АЗПОЛ в липосомах и ингибировал оба типа процесса ПОЛ в гомогенате головного мозга: на 20 7. - АЗПОЛ и на 40'/. - ФПОЛ. Феназе-пам при концентрациях 10~5- 10~3 М подобно дифенину не влиял на АЗПОЛ в яичном лецитине и ингибировал АЗПОЛ и ФПОЛ в гомогенате мозга, соответственно на 30 и 50 У., Наконец, вальпроат натрия в концентрации до 10~4М не влиял на АЗПОЛ в липосомах и гомогенате и ингнбировал на 257. ФПОЛ в гомогенате головного мозга.
Итак, из 4-х апробированных соединений, по всей вероятности, ни одно не является истинным АО, поскольку на АЗПОЛ в, простой не иетаболизирующей системе - в липосомах не влияет. Вместе с тем фенобарбитал и вальпроат натрия ингибировали соответствен-
но АЗПОЛ и ФПОЛ в гомогенате головного мозга, а днфенин и фена-зепам ингибировалн в гомогенате оба типа ПОЛ. Ранее ингибирующее влияние других барбитуратов, в частности тиопентала, на ПОЛ в гомогенате головного мозга обнаружили Smith et al. (1979). По-видимому, влияние данных препаратов на скорость накопления ТБКП в гомогенатах нервной-ткани обусловлено их влиянием на определенные компоненты в системе регуляции процесса ПОЛ в нервной системе, причем это влияние может быть непрямым. Выяснить конкретные мишени для исследованных препаратов, связанные с системой регуляции ПОЛ, пока не удалось. Можно лишь полагать, что для фенобарбитала, дифенина и феназепама, и вальпроата натрия они различны.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об ин-гибирующем влиянии фармакологических препаратов, широко используемых в протнвосудорожнон терапии, на активность ПОЛ в нервной ткани.Возможно, это усиливает или даже в определенной степени обусловливает их антиэпилептическое действие. В любом случае результаты этих исследований подтверждают важность некомпенсированной активации ПОЛ в ЦНС для патогенеза ЭпА.
Глава VI. МЕХАНИЗМ НАРУШЕНИИ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЦЕССА ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИИ ЛИПМДОВ ПРИ РАЗВИТИИ ЭПИЛЕПТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.
Принципиальными причинами некомпенсированной активации ПОЛ в тканях организма животного п человека могут быть недостаточность АОС при нормальном, неизменном уровне инициирования ПОЛ и активация реакций инициирования л/лли разветвления свободноради-кальных цепей при сохраненной, сниженной или недостаточно увеличенной для новой ситуации активности АОС. Изучение причин дисбаланса в системе регуляции ПОЛ, обнаруженного при развитии ЭпА, было начато нами с исследования состояния АОС.
Состояние АОС в ЦНС к рыси и в ее организме в целом оценивали по величине параметров этой системы соответственно в ткани головного мозга и в периферической крови животного. В качестве параметров АОС определяли активность основных "антиоксидантных" ферментов: СОД,ГП и ГР, а также измеряли содержание главного антиоксиданта организма животных п человека - ТФ.
В 1-ой серии опытов тибрили значения параметров АОС при постепенном увеличении у ьрис с/доромюп готовности, наолюдаю-
щемся в процессе кораэолового "кнндлинга". Как и в случае с определением ТБКП, животные по степени судорожной готовности были разделены на 3 группьг.1) крысы без судорожной активности (5-е сутки"киндлинга"); 2) животные с повторными клоническими судорогами всего туловища (17-е сутки) и 3) крысы с клонико-тонически-ми судорогами (32-е сутки). Установлено, что в головном мозге и крови крыс, которым вводили субпороговые дозы конвульсанта, активность "антиоксидантных" ферментов и уровень ТФ не изменяются по сравнению с контролем. Это свидетельствует о неизменности активности ДОС в ЦНС кнеотиых при постепенном повышении чувствительности их головного мозга к воздействию эпилептогена. Данный факт хорошо согласуется с отсутствием при "киндлинге" изменений уровня в головном мозге крыс ТБКП п подтверждает справедливость вывода о вторпчности нарушений регуляции процесса ПОЛ при генезе ЭпА.
Во 2-ой серии экспериментов величину параметров ДОС в ЦНС и крови крыс определяли в динамике развития у животных первично-генерализованной ЭпА.Исследования проводили в три периода развития ЭпА: 1) период начальных судорожных проявлений, 2) через 1-2 мин после приступа генерализованных судорог; 3) через 13-15 мин после приступа генерализованных судорог. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в динамике развития первично-генерализованной ЭпА активность ферментов АОС в головном мозге крыс и содержание в нем ТФ не изменяется. В крови крыс через 13-15 мин после приступа судорог активность ГП и ГР, а также содержание ТФ сохранялись на неизменном уровне. Вместе с тем в крови животных на этой стадии было обнаружено существенное снижение активности СОД, которое составило 20-30У. от контроля. Через 13-15 мин после приступа генерализованных судорог уменьшалась и лерекнсная резистентность эритроцитов. Поскольку перекисная резистентность эритроцитов зависит и от уровня в крови продуктов ПОЛ, и от активности АОС эритроцитов, то вполне возможно, что снижение перекисной резистентности эритроцитов обусловлено действием двух причин одновременно. С одной стороны, увеличением уровня продуктов ПОЛ в крови, обнаруженным после приступа генерализованных судорог, и понижением активности эритроцитарной СОД, с другой стороны.
Итак, проведенные опыты показали, что острое развитие
первично-генерализованной ЭпА не сопровождается какими-либо изменениями компонентов ДОС в ННС животных. Следовательно, некомпенсированная активация ПОЛ, возникающая при индукции быстро развивающейся ЭпА не связана с ослаблением функционирования АОС. Однако это не означает, что сохранение активности АОС в ЦНС на неизменном уровне при развитии ЭпА оказывается достаточным для контролирования процесса ПОЛ. Более того, накопление в ЦНС при ЭпА продуктов ПОЛ указывает на функциональную недостаточность АОС. Проверить справедливость данного вывода можно, исследуя влияние увеличения мощности АОС на эффективность действия кон-вульсанта и активность в нервной ткани процесса ПОЛ.
Увеличить мощность (активность) в тканях АОС можно различными способами, в том числе и с помощью введения животным АО или препаратов антиоксидантных ферментов. В предыдущей главе было показано, что введение крысам разных АО и в первую очередь ТФ и ионола, проникающих через гематоэнцефалпческий барьер, предупреждает активацию в ЦНС процесса ПОЛ, вызываемую введением кон-вульсантов, и резко уменьшает эффективность их действия. Следовательно, исходная мощность АОС оказывается недостаточной для поддержания гомеостаза в системе регуляции ПОЛ после воздействия конвульсантов. Об этом же свидетельствуют и результаты изучения влияния введения препарата СОД на очаговую ЭпА,а также на интенсивность в области очага ЭпА процесса ПОЛ. Предварительно было установлено, что сам пенициллин на активность СОД не влияет.
Введение СОД в дозе 1 иг/кг массы не влияло на активность данного фермента в коре головного мозга интактных крыс. Судя по этим данным, СОД в нормальных условиях не проникает через гема-тоэнцефалическии барьер. Однако при развитии ЭпА проницаемость гематоэнцефалического барьера для СОД может возрастать как это имеет место для других макромолекулярных соединений. Оценить влияние введения экзогенной СОД на активность данного фермента в очаге ЭпА сложно из-за недостаточности количества отбираемой из очага ткани. Вместе с тем, этой ткани достаточно для определения в очаге ЭпА уровня ТБКП.. Воспользовавшись этим, мы установили, что предварительное введение крысам препарата СОД приводит к уменьшению содержания ТБКП в коре головного мозга (область очага ЭпА) животных с ЭпА, то есть ослабляет эффект активации ПОЛ. вызываемый конвульсантом. Это свидетельствует о проницаемости
гематоэнцефалического барьера для СОД при судорогах, а также о том, что введение препарата СОД увеличивает мощность АОС коры головного мозга животных с ЭпА.
Одновременно с ослаблением ПОЛ в ЦНС предварительное введение крысам СОД вызывало существенное уменьшение эффективности действия на' них конвульсанта (пенициллина). Увеличивалась длительность латентных периодов появления первого НИР и первого ИР, а также резко снижалось число ИР, регистрируемых за время жизни очага ЭпА. Это свидетельствует о перспективности использования препаратов СОД в терапии заболеваний, связанных с нарушениями регуляции ПОЛ, проявляющимися некомпенсированной активацией данного процесса. Так как в этом случае даже при отсутствии "структурной" недостаточности АОС, очевидно, имеет место ее функциональная недостаточность.
Итак, по всей вероятности, исходной причиной активации процесса ПОЛ в ЦНС при развитии ЭпА является интенсификация реакций инициирования и разветвления свободнорадикальных цепей при сохраненной (по крайней мере на первых этапах эпилептогенеза) активности АОС. Можно предположить несколько путей, способных привести к активации реакций инициирования и разветвления ПОЛ. Это, во-первых, увеличение содержания в нервной ткани окислителя - 02 ;во-вторых, увеличение содержания субстрата переокисления - ПНЖК или его доступности инициаторам и катализаторам; в третьих, усиление образования инициаторов ПОЛ в ферментативных процессах, в частности активация генерации 0" , Н202 и ОН" в электронпереносящих цепях; и в четвертых, возрастание уровня или активности катализаторов ПОЛ, например, ионов железа. Рассмотрим вероятность этих вариантов.
Имеются данные, свидетельствующие о значительном возрастании локального кровотока в головном мозге животных уже в первые минуты после воздействия конвульсанта, что говорит об усилении снабжения нервной ткани кислородом! В. Ме1с1гит, 1983; В^ез^, Т.У1е1осЬ, 1986). Однако этот эффект наблюдается одновременно с резкой активацией в нейронах кислород-зависимых метаболических процессов, так что возникает относительная недостаточность поступающего 02 для нужд клеточного метаболизма, перешедшего на новый,значительно более высокий уровень. Следовательно, значимое для ПОЛ увеличение в нервной ткани концентрации свободного кис-
лорода при возникновении ЭпА вряд ли возможно.
Маловероятно и то, что причиной активации ПОЛ при ЭпА явля-.я увеличение содержания в ЦНС субстрата переокисления, то ,'сть ПИК. Как показали исследования (B.Siesjo et al.,1980), суммарный уровень в головном мозге ПНИ остается неизменным в течении 1 ч периодической ЭпА.
Вопрос об изменении при ЭпА доступности ПНЖК инициаторам и катализаторам ПОЛ более сложен. В нервной ткани ПНИ находятся в основном во фракции фосфолипидов, причем, как правило, во 2-ом положении молекулы фосфолипида (М. But1ег,С.Abood,1982). Поэтому увеличение доступности ПНЖК инициаторам и катализаторам ПОЛ потенциально возможно либо при гидролизе молекул фосфолипидов с помощью фосфолипазы Аг, в результате чего образуются СЖ, полиненасыщенные связи которых более доступны активаторам ПОЛ, либо при общем "разрыхлении" нейрональных мембран.Если это заключение справедливо, то активность ПОЛ в нервной ткани должна находиться в прямой зависимости от активности в ней фосфолипазного гидролиза липидов (ФГЛ). Чтобы установить существует ли такая зависимость на самом деле, мы исследовали взаимосвязь процессов ПОЛ и ФГЛ в нативных синаптосомах, а также в синаптосомах предварительно обработанных инициаторами и ингибиторами данных процессов. При этом об активности ПОЛ и ФГЛ судили по уровню в суспензии синаптосом ТБКП и СЖК соответственно. Результаты этих опытов свидетельствуют о существовании выраженной прямой зависимости интенсивности ПОЛ в нервных окончаниях от активности в них ФГЛ. Это хорошо согласуется с данными J.Beckman с соавт. (1987), наблюдавшими аналогичный эффект в микросомах печени. По всей вероятности, механизм этого эффекта следующий. Активация фосфо-липаз типа А приводит к накоплению в мембранах СИ и лизоформ ФЛ, что сопровождается вследствие хаотропного действия продуктов гидролиза уменьшением вязкости липидного бислоя мембран. В результате увеличивается доступность субстрата окисления - двойных связей ПНЖК для инициаторов и прооксидантов. Другая причина -увеличение содержания ПНЖК в свободном состоянии, в котором они окисляются с существенно большей скоростью, чем эстерифицирован-ные ЖК (М.Н. Мерзляк и др,19751.
Итак, активация ФГЛ в нервной.ткани в принципе может быть причиной активации в ней процесса ПОЛ. Далее следовало выяснить,
сохраняется ли зависимость интенсивности ПОЛ в нервных клетках от интенсивности в них ФГЛ в естественных условиях и в условиях воздействия на ЦНС эпилептогена. Для получения ответа на этот вопрос была изучена активность ПОЛ в сннаптосомах при разных способах их деполяризации. Целесообразность проведения этих опытов диктовалась тем, что, во-первых, стойкая деполяризация нейрональной мембраны является одним из наиболее характерных признаков изменения ее свойств при эпилептогенезе. Во-вторых, тем, что деполяризация синаптосом приводит, как известно (В.Brad
